产品概况

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA）。往预先包被猪热休克蛋白90(HSP-90)抗体的包被酶标板孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的猪热休克蛋白90(HSP-90)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

注:使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

试剂盒性能

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2. 批内变异系数与批间变异系数应小于10%。

需自备的试剂盒器材

1. 标准规格酶标仪
2. 37℃恒温箱
3. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
4. 去离子水，用来稀释洗涤缓冲液

样品收集、处理方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，室温血液自然凝固10 - 20分钟，2000 - 3000 rpm离心20分钟，将血清和红细胞迅速小心地分离，收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂。混合10 - 20分钟后，2000 - 3000 rpm离心20分钟。收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
3. 细胞上清液：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。 2000 - 3000 rpm离心20分钟，收集上清。
4. 组织匀浆：标本采集后用液氮迅速冷冻保存备用。使用时取适量标本，加入一定量的 PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分后，2000 - 3000 rpm离心20分钟，收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

样品保存

如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

实验步骤

1. 从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需酶标板孔数目，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 标准品和样本加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL。样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL，空白孔不加。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 加酶：标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔。
4. 温育：37 ℃水浴锅或恒温箱温育 60分钟。
5. 配液：将20X浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。
6. 洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
   [洗板方法]
   手工洗板：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，酶标板倒扣在吸水纸上拍干，反复5次。
   自动洗板：每孔注入洗液350 μL，浸泡1分钟，洗板5次。
7. 显色：每孔加入底物 A、B 各 50 μL，轻轻震荡混匀后，37 ℃ 避光孵育 15min。
8. 终止：每孔加入终止液 50μL，终止反应，此时蓝色立刻转为黄色。
9. 测定：以空白孔调零，15分钟内在450 nm 波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。

结果计算

绘制标准曲线：在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 试剂盒保存在 2 – 8 ℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，属于正常现象，可水浴加热使结晶完全溶解后再使用。初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 要严格避免操作过程中酶标板干燥，干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
3. 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
4. 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用;剩余的酶标板请放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
5. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

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